|
|
Příprava konstruktů pro izolaci proteinů a jejich testování
Osadchuk, Olha ; Kostovová, Iveta (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato práce je zaměřená na popis produkce rekombinantních proteinu. Pro studium dané problematiky byl zvolen protein p53, který je jedním z hlavních nádorových supresorových proteinu. Protein p53 je zodpovědný za regulaci mnoha genů, které mohou kontrolovat buněčný cyklus a replikaci DNA, a je nejčastěji mutovaným genem u nádorových onemocněni člověka. Pro danou prací byly zvolený různé varianty bodových mutaci proteinů p53, které mohou ovlivnit jeho vazebné vlastnosti a funkce. Znalosti mechanizmu působení mutovaných p53 proteinů v buňce je důležité pro efektivní léčbu rakoviny. V teoretické části jsou popsaný vlastnosti proteinu a jednotlivé expresní systémy, metody Gateway klonováni, a metody použité při purifikaci a izolaci proteinů (afinitní chromatografie, SDS-PAGE analýza a Western blot analýza). V experimentální časti jsou popsané postupy přípravy expresních vektoru pomoci Gateway technologie, transformace do buněk a izolace plazmidové DNA. Klonováním byly připraveny tři expresních klony a po jejich transformace do kompetentních buněk byla provedena izolace DNA.
|
|
|
Produkce a purifikace izoforem proteinu p53 v bakteriálním expresním systému
Vadovičová, Natália ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Protein p53 není jediným proteinem, který je kódován tumor-supresorovým genem TP53. Alternativním sestřihem, alternativním použitím promotoru a alternativními počátky translace může dojít k expresi až jedenáct dalších izoforem. Tyto izoformy byly ve zvýšeném množství pozorovány v nádorových tkáních. Jelikož jsou izoformy proteinu p53 sekvenčně, a tedy i strukturně odlišné oproti proteinu p53, mění se tím i jejich vazebné vlastnosti a funkce v buňce. Izoformy modulují funkci samotného proteinu p53, některé podporují jeho tumor-supresorovou funkci, jiné ji naopak potlačují. Objasnění mechanismu působení izoforem na děje v buňce by mohlo být využito k cílenému alternativnímu sestřihu vhodných izoforem a v léčbě rakoviny pomocí terapie založené na proteinu p53. Teoretická část diplomové práce shrnuje základní poznatky o proteinu p53 a o jeho izoformách, doplněné o výsledky výzkumů z posledních let týkajících se těchto izoforem. Dále je probrána použitá metoda, Gateway klonování. Cílem experimentální části práce byla produkce izoforem v bakteriálním expresním systému. Produkci předcházela příprava DNA sekvencí těchto dvanácti izoforem pomocí PCR a Gateway klonování. Klonováním bylo připraveno celkem dvanáct entry klonů obsahujících sekvence všech izoforem a také osm expresních klonů. Zároveň byly izolací získány a pomocí SDS-PAGE a Westernového přenosu ověřeny čtyři izoformy proteinu p53, a to p53, 40p53, 40p53 a 40p53. U izoforem budou v rámci navazujícího výzkumu testovány jejich DNA vazebné vlastnosti.
|
|
|
Příprava konstruktů pro izolaci proteinů a jejich testování
Osadchuk, Olha ; Kostovová, Iveta (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato práce je zaměřená na popis produkce rekombinantních proteinu. Pro studium dané problematiky byl zvolen protein p53, který je jedním z hlavních nádorových supresorových proteinu. Protein p53 je zodpovědný za regulaci mnoha genů, které mohou kontrolovat buněčný cyklus a replikaci DNA, a je nejčastěji mutovaným genem u nádorových onemocněni člověka. Pro danou prací byly zvolený různé varianty bodových mutaci proteinů p53, které mohou ovlivnit jeho vazebné vlastnosti a funkce. Znalosti mechanizmu působení mutovaných p53 proteinů v buňce je důležité pro efektivní léčbu rakoviny. V teoretické části jsou popsaný vlastnosti proteinu a jednotlivé expresní systémy, metody Gateway klonováni, a metody použité při purifikaci a izolaci proteinů (afinitní chromatografie, SDS-PAGE analýza a Western blot analýza). V experimentální časti jsou popsané postupy přípravy expresních vektoru pomoci Gateway technologie, transformace do buněk a izolace plazmidové DNA. Klonováním byly připraveny tři expresních klony a po jejich transformace do kompetentních buněk byla provedena izolace DNA.
|
|
|
Produkce a purifikace izoforem proteinu p53 v bakteriálním expresním systému
Vadovičová, Natália ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Protein p53 není jediným proteinem, který je kódován tumor-supresorovým genem TP53. Alternativním sestřihem, alternativním použitím promotoru a alternativními počátky translace může dojít k expresi až jedenáct dalších izoforem. Tyto izoformy byly ve zvýšeném množství pozorovány v nádorových tkáních. Jelikož jsou izoformy proteinu p53 sekvenčně, a tedy i strukturně odlišné oproti proteinu p53, mění se tím i jejich vazebné vlastnosti a funkce v buňce. Izoformy modulují funkci samotného proteinu p53, některé podporují jeho tumor-supresorovou funkci, jiné ji naopak potlačují. Objasnění mechanismu působení izoforem na děje v buňce by mohlo být využito k cílenému alternativnímu sestřihu vhodných izoforem a v léčbě rakoviny pomocí terapie založené na proteinu p53. Teoretická část diplomové práce shrnuje základní poznatky o proteinu p53 a o jeho izoformách, doplněné o výsledky výzkumů z posledních let týkajících se těchto izoforem. Dále je probrána použitá metoda, Gateway klonování. Cílem experimentální části práce byla produkce izoforem v bakteriálním expresním systému. Produkci předcházela příprava DNA sekvencí těchto dvanácti izoforem pomocí PCR a Gateway klonování. Klonováním bylo připraveno celkem dvanáct entry klonů obsahujících sekvence všech izoforem a také osm expresních klonů. Zároveň byly izolací získány a pomocí SDS-PAGE a Westernového přenosu ověřeny čtyři izoformy proteinu p53, a to p53, 40p53, 40p53 a 40p53. U izoforem budou v rámci navazujícího výzkumu testovány jejich DNA vazebné vlastnosti.
|
host ::
RSS.